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南京信帆生物:銀染核仁形成區(qū)與近端著絲粒染色體隨體聯(lián)合
更新時(shí)間:2016-05-02   點(diǎn)擊次數(shù):1054次

AgNO3 Staining NOR and Salite Association of Acrocentric Chromosome

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br />熟悉銀染的原理和方法。

【實(shí)驗(yàn)原理】
人類近端著絲粒染色體的副縊痕與核仁形成有關(guān),故稱為核仁形成區(qū)(NOR)。當(dāng)位于此處的18S、28S核糖體RNA的基因(rDNA)具有轉(zhuǎn)錄活性時(shí),應(yīng)用銀染技術(shù)可使NOR特異性著色(褐黑色)。進(jìn)一步證明銀染物質(zhì)不是rDNA,亦不是rRNA,可能是核仁形成區(qū)特異的蛋白質(zhì),即和rRNA轉(zhuǎn)錄相的酸性蛋白。人類核糖體RNA基因位于5對(duì)近端著絲點(diǎn)染色體短臂的次猛痕處,即人類的核仁形成區(qū)。在正常人中, 不是所有核仁形成區(qū)均被銀染,其范圍大約4-10。應(yīng)用銀染法可以覺(jué)察正常人體核糖體RNA基因的活動(dòng)。此外,人類近端著絲粒染色體的隨體間易發(fā)生聯(lián)合,應(yīng)用銀染技術(shù)可在發(fā)生聯(lián)合的染色體間清楚地看到銀染物質(zhì)相連。因此,應(yīng)用銀染核仁形成區(qū)(Ag-NOR)與近端著絲粒染色體隨體聯(lián)合(Ag-AA)技術(shù),可以分析有活性的rRNA基因的動(dòng)態(tài)變化。正常人Ag-NOR平均為5.8/細(xì)胞。

【實(shí)驗(yàn)用品】
1. 恒溫水浴箱、顯微鏡、平皿、牙簽、擦鏡紙、鑷子;
2. 預(yù)制染色體玻片標(biāo)本、0.1%甲酸、AgNO3(50%)。1:20 Giemsa,5mol/L HCl。

【實(shí)驗(yàn)步驟】
1. 按半微量法采取外周靜脈血,接種培養(yǎng)。常規(guī)法制片。將染色體玻片標(biāo)本在室溫下放置2~3天。
2. 將標(biāo)本置入5mol/L HCl溶液中常溫處理5分鐘,蒸餾水沖洗2-3次,甩干。
3. 將500mg AgNO3溶于1 ml 0.1%甲酸溶液中,混勻后立即滴4~5(5ml)滴至玻片標(biāo)本上。
4. 在平皿中平行放置兩根牙簽,將玻片標(biāo)本放在牙簽上。
5. 在標(biāo)本上蓋一張比玻片稍小的擦鏡紙,用鑷子掀動(dòng)紙片數(shù)次,使染液均勻分散在標(biāo)本上。
6. 將平皿置于60℃水浴箱中處理3-5分鐘,直至擦鏡紙呈棕黃色終止反應(yīng)。
7. 蒸餾水沖洗去擦鏡紙,以1:20 Giemsa染液復(fù)染3分鐘。水洗,氣干。
8. 鏡下觀察。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】
1. Ag-NOR的計(jì)數(shù):選擇銀染著色清晰的分裂相,計(jì)數(shù)6個(gè)D組(13、14、和15號(hào)染色體)和4個(gè)G組(21和22號(hào)染色體)近端著絲粒染色體,不論單側(cè)或雙側(cè)的銀染點(diǎn)都計(jì)數(shù)為一個(gè)有銀染的染色體。
2. Ag-AA計(jì)數(shù):凡近端著絲粒染色體之間有銀染物質(zhì)相連的,均計(jì)數(shù)為Ag-AA。涉及2條近端著絲粒染色體的聯(lián)合,記為1個(gè)Ag-AA;涉及3條近端著絲粒染色體的聯(lián)合,如未形成閉環(huán)的,記為2個(gè)Ag-AA;3條染色體聯(lián)合形成閉環(huán)時(shí),記為3個(gè)Ag-AA;依此類推。

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