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南京信帆生物:輕松捕獲microRNA的靶標(biāo)
更新時間:2016-05-17   點擊次數(shù):1341次

microRNA(miRNA)分子雖小,卻在基因表達(dá)的調(diào)控上發(fā)揮著重要作用。為了更好地了解miRNA影響健康和疾病的機(jī)制,我們首先需要知道m(xù)iRNA會對哪些基因起作用。然而,這并非易事。每個miRNA都能夠調(diào)控數(shù)以百計的靶基因。之前的miRNA靶標(biāo)預(yù)測主要是通過一些算法來實現(xiàn),而Clontech公司(Takara旗下)近日推出一種新工具,能協(xié)助鑒定細(xì)胞中的miRNA靶標(biāo)。

這一工具名為MirTrap系統(tǒng)。它利用RISC蛋白的顯性失活突變體,允許miRNA與其靶標(biāo)結(jié)合,但限制進(jìn)一步的加工。此亞基整合到內(nèi)源的Argonaute/RISC復(fù)合物中,并“鎖定”miRNA-靶標(biāo)mRNA。顯性失活亞基上的DYKDDDDK(FLAG表位)標(biāo)簽允許整個Ago/RISC復(fù)合物的捕獲和分離。這樣就能實現(xiàn)miRNA及其靶標(biāo)的免疫沉淀,從而通過新一代測序或定量PCR來鑒定或定量。

 

整個過程大致如下:

1. 創(chuàng)建miRNA模擬物。
2. 將這些miRNA模擬物和pMirTrap載體共轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞,并孵育24小時。同時利用miR-132、pMirTrap載體和pMirTrap對照載體開展對照轉(zhuǎn)染。
3. 利用附帶的MirTrap分離試劑盒裂解轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)物。
4. 利用分離試劑盒中的磁珠對RISC復(fù)合物(其中包括靶標(biāo)mRNA)進(jìn)行免疫沉淀。
5. 利用附帶的NucleoSpin RNA XS試劑盒分離與磁珠結(jié)合的靶標(biāo)mRNA。
6. 通過qPCR或新一代測序分析分離出的RNA,鑒定出特定miRNA的靶標(biāo)mRNA。

MirTrap系統(tǒng)中包含了pMirTrap載體、免疫沉淀及后續(xù)分離所需的試劑、Xfect microRNA轉(zhuǎn)染試劑以及對照試劑,足夠15次分析使用。

Xfect microRNA轉(zhuǎn)染試劑也是Clontech推出的產(chǎn)品。它形成可生物降解的納米顆粒,從而實現(xiàn)miRNA的轉(zhuǎn)染。此試劑盒提供兩種轉(zhuǎn)染聚合物:Xfect MicroRNA Transfection Polymer,這是為小RNA的轉(zhuǎn)染而優(yōu)化的;Xfect Polymer,這是為質(zhì)粒DNA而優(yōu)化的。

在miRNA轉(zhuǎn)染時,只需要Xfect MicroRNA Transfection Polymer;而在miRNA與質(zhì)粒DNA的共轉(zhuǎn)染時,須在轉(zhuǎn)染反應(yīng)中加入少量的Xfect Polymer。轉(zhuǎn)染過程可在血清存在時開展。

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